核酸计量：基因检测的“砝码”

上海市计量测试技术研究院 杨雪 刘刚

分子生物学检测手段的迅速发展,推动基因分析的广泛应用,覆盖领域包括医学检测、微生物定性定量、转基因检测等。基因定量的可比性和可靠性,关系到人们的身体健康甚至生命安全,同时也是支撑生命科学发展的技术基础。

生物计量领域中,基因定量的量值溯源一直是一个技术挑战,不仅缺少高精确度高灵敏度的定量策略,无法把DNA拷贝数量值连接到国际单位,同时也缺少具有准确量值的DNA标准物质,不能实现方法结果确认,也无法开展仪器计量校准,影响了检测结果的国际国内互认,阻碍了基因分析科学技术的应用扩展,临床诊断的误判更难免造成不必要的经济成本,甚至影响人们的身体健康。

在全世界计量领域科学家的努力下,生物计量取得了一定的成果,国际计量局物质的量咨询委员会成立了生物分析工作组,推动核酸测量、蛋白质测量及其方法、分析过程的标准化,以及标准物质的研制。世界上多个国家建立了生物计量研究实验室,我国也建立了包括中国计量科学研究院、上海市计量测试技术研究院等计量研究机构。近年来,中国的生物计量基础研究取得重要进展,研制生物标准物质超过300项。

其中,我们的科研团队自2009年以来持续系统的研究了多种核酸定量方法,提出了DNA量值溯源新途径,提高了检测的灵敏度和准确度,全面考察了不确定来源,开展了一系列开创性的核酸标准物质的研发,首次实现了核酸定量分析仪器的计量校准以及检测实验室的能力比对工作。

在方法研究方面,跳出了利用紫外分光光度计定量核酸分子的传统模式,创新的开展了多种核酸定量方法的研究,利用高分辨电感耦合等离子体质谱法开展核酸分子中磷元素的定量研究,从而实现了DNA量值的溯源,提高了结果的可靠性;发现了引物设计以及目标DNA构型对于dPCR定量结果准确度的影响,通过关键引物序列设计,构建全新的PCR检测系统,最终实现了高灵敏度的dPCR定量。

在系统分析定量方法的不确定度的基础上,提出了多方法联合定值机制,研制了30种质粒DNA标准物质,标准物质均匀性良好,稳定性超过一年,相对扩展不确定度达到5%以内,为一系列核酸定量分析仪器的计量校准提供了计量支撑,突破了DNA定量检测量传的技术瓶颈,广泛应用于实时荧光定量PCR、微量核酸蛋白定量仪等DNA定量分析仪器的计量校准。另一方面,该套标准物质为PCR相关检测提供可靠的工作标准、质量控制依据,保证检测结果的可比性、有效性,利用项目在方法研究和标准物质方面的成果。

新冠疫情爆发之初,我们研制了两种“新型冠状病毒体外转录RNA标准物质”,利用体外转录方法制备,采用数字PCR方法对新型冠状病毒RNA标准物质浓度进行测定,以新型冠状病毒E、N和ORF1ab三个基因为目标,涵盖世界卫生组织和中国疾病预防控制中心公布的关键检测区域。

这两个国家级病毒RNA标准物质可以为病毒RNA检测方法研发提供靶标;可以直接用于质量控制,对核酸试剂盒灵敏度、线性范围以及靶向基因区域等进行确认;也可以为检测实验室提供RNA阳性样品,预警假阴性结果的出现,为病毒RNA检测提供量值溯源的“砝码”。

目前,我国科学家还在紧急研制多种其他病毒标准物质中,比如副流感病毒、人乳头瘤病毒、乙型肝炎病毒、柯萨奇病毒A16型以及肠道病毒71型等,为病毒核酸检测添加更多的“砝码”。